實驗 蛋白質的沉淀反應與顏色反應
一、實驗目的
掌握鑒定蛋白質的原理和方法。熟悉蛋白質的沉淀反應，進一步熟悉蛋白質的有關反應。
二、實驗原理
蛋白質分子中某種或某些集團可與顯色劑作用，產生顏色。不同的蛋白質由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應亦不完全相同。顏色反應不是蛋白質的專一反應，一些非蛋白物質也可產生同樣的顏色反應，因此不能根據顏色反應的結果來決定被測物是否為蛋白質。另外，顏色反應也可作為一些常用蛋白質定量測定的依據。蛋白質是親水性膠體，在溶液中的穩定性與質點大小、電荷、水化作用有關，但其穩定性是有條件的，相對的。如果條件發生了變化，破壞了蛋白質的穩定性，蛋白質就會從溶液中沉淀出來。
三、實驗儀器
1、吸管 2、滴管 3、試管 4、電爐 5、pH試紙 6、水浴鍋7、移液管
四、實驗試劑
1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。
2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸餾水稀釋至200ml。
3、Millon’s試劑：40g汞溶于60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混勻，取上清夜備用。此試劑可長期保存。
4、尿素晶體
5、1%CuSO：1g CuSO晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml 44
6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸餾水，稀釋至100ml
7、濃硝酸
8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀釋至100ml.
9、 冰醋酸
10、濃硫酸
11、飽和硫酸銨溶液：100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。
12、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸鉛溶液：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml
15、氯化鈉晶體
16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml
17、飽和苦味酸溶液：100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。 18、1%醋酸溶液。
五、實驗步驟
蛋白質的顏色反應
（一） 米倫（Millon’s）反應
1、苯酚實驗：取0.5%苯酚溶液1ml于試管中，加Millon’s試劑0.5ml，電爐小心加熱觀察顏色變化。
2、蛋白質實驗：取2ml蛋白液，加Millon’s試劑0.5ml，出現白色的蛋白質沉淀，小心加熱，觀察現象。
（二） 雙縮脲反應
1、取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱熔化，至重新結晶時冷卻。然后加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察現象。
2、取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察現象。
（三） 黃色反應
取一支試管，加入1ml蛋白液及濃硝酸5滴。加熱，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，觀察顏色有什么變化。
（四） 茚三酮反應
取蛋白液1ml于試管中，加4-8滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍紫色出現。
蛋白質的沉淀
（一）蛋白質的鹽析作用
1、試管中加蒸餾水3ml，加固體硫酸銨至飽和。另一支試管加蛋白液2ml，再加入飽和硫酸銨溶液2ml，搖勻靜置觀察現象。
2、將上述混合液過濾。向濾液中逐漸加入少量固體硫酸銨，直至飽和為止，此時析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。
（二）有機溶劑沉淀蛋白質
試管中加蛋白液1ml，加晶體氯化鈉少許，溶解后加95%乙醇3ml,搖勻，觀察現象。
（三）重金屬鹽與某些有機酸沉淀蛋白質
1、取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產生。
2、取一支試管加蛋白液2ml，再加入10%三氯乙酸1ml，充分混勻，觀察結果。
（四）生物堿試劑沉淀蛋白質
取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸數滴，觀察現象。
六、實驗結果
蛋白質的顏色反應
（一） 米倫（Millon’s）反應
1、苯酚實驗：
溶液即出現玫瑰紅色。
2、蛋白質實驗：
出現白色的蛋白質沉淀，小心加熱后凝固的蛋白質出現紅色。
（二） 雙縮脲反應
1、有紫色出現。
2、溶液有藍紫色出現
（三） 黃色反應
先有黃色沉淀生成，加入10%NaOH溶液1ml后顏色變為橘黃色。
（四） 茚三酮反應
有藍紫色出現。
蛋白質的沉淀
（一）蛋白質的鹽析作用
1、有蛋白析出。
2、有蛋白質析出，加水后可復溶。
（六）有機溶劑沉淀蛋白質
取一試管加蛋白液1ml，，加入晶體氯化鈉少許，待溶解后再加95%乙醇3ml,搖勻，觀察現象
（七）重金屬鹽與某些有機酸沉淀蛋白質
取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1%硫酸銅溶液，至有沉淀產生。
（八）生物堿試劑沉淀蛋白質
取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸和鞣酸數滴，觀察現象。
七、 實驗分析
蛋白質分子中某種或某些集團可與顯色劑作用，產生顏色。不同的蛋白質由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應亦不完全相同。
其中米倫試劑能與苯酚及某些二羥基苯衍生物起顏色反應，而組成蛋白質的氨基酸中酪氨酸含苯酚基團，因此可用米倫試劑檢測蛋白質中酪氨酸的存在。尿素被加熱，形成雙縮脲，在堿性環境中，能與硫酸銅結合成紫色的化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中含有肽鍵與縮脲結構相似，也能進行此反應。蛋白質分子中含有苯環結構的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于濃硝酸可反應并生成黃色物質，此物質在堿性環境下變為桔黃色的硝基苯衍生物硝醌酸等。蛋白質與茚三酮共熱，產生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切蛋白質及a-氨基酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應呈黃色，含有氨基的其他物質亦呈此反應
蛋白質是親水性膠體，在溶液中的穩定性與質點大小、電荷、水化作用有關，但其穩定性是有條件的，相對的。如果條件發生了變化，破壞了蛋白質的穩定性，蛋白質就會從溶液中沉淀出來。向蛋白質中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所中和。于是穩定因素被破壞，蛋白質聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質變性。某些有機溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質脫去水化層以及降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用，致使蛋白質顆粒容易凝聚而沉淀。重金屬離子（如Pb2+、Cu2+等）與蛋白質的羧基等結合生成不溶性的金屬鹽類而沉淀，同時蛋白質發生變性。某些有機酸的酸根則與蛋白質的自由氨基結合而沉淀。
植物體內具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為生物堿。能沉淀生物堿或與其產生顏色反應的物質稱為生物堿試劑，如鞣酸等。當溶液PH小于等電點時，蛋白質顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負離子發生反應而沉淀。
蛋白質變性（protein denaturation）是指蛋白質在某些物理和化學因素作用下其特定的空間構象被改變，從而導致其理化性質的改變和生物活性的喪失。一般認為蛋白質的二級結構和三級結構有了改變或遭到破壞，都是變性的結果。能使蛋白質變性的化學方法有加強酸、強堿、重金屬鹽、尿素、乙醇、丙酮等；能使蛋白質變性的物理方法有加熱(高溫)、紫外線及X射線照射、超聲波、劇烈振蕩或攪拌等。
如果變性條件劇烈持久，蛋白質的變性是不可逆的。如果變性條件不劇烈，這種變性作用是可逆的。這時，如果除去變性因素，在適當條件下變性蛋白質可恢復其天然構象和生物活性，這種現象稱為蛋白質復性（renaturation）。例如胃蛋白酶加熱至80～90℃時，失去溶解性，也無消化蛋白質的能力，如將溫度再降低到37℃，則又可恢復溶解性和消化蛋白質的能力。
蛋白質變性的應用價值
醫學：
臨床上的消毒和滅菌---使病原微生物變性
注射及外傷采用75%乙醇滅菌
手術器械及其它用品采用高溫高壓滅菌
手術室用紫外線滅菌
用熱凝法檢查尿蛋白
實驗室：
防止蛋白質變性：在生產和保存激素、酶、抗體血清等具有生物活性的蛋白質（如酶、疫苗、免疫血清等）時，應防止其變性失活，其中在低溫條件下生產與貯存以上蛋白質就是這個道理。
實驗室的滅菌：細胞培養室等亦用紫外線照射消毒滅菌。 日常生活：
熟食較生食易消化：因為蛋白質變性后，肽鏈構象由卷曲變為伸展，使肽健暴露，易被蛋白水解酶消化水解。
其中鹽析法作為一種蛋白質膠體簡便的提取手段被廣泛應用于工業生產。
鹽析法是在中藥水提液中,加入無機鹽至一定濃度,或達飽和狀態,使某些成分在水中溶解度降低,從而與水溶性大的雜質分離。
如向蛋白質溶液中加入某些濃的無機鹽[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋白質凝聚而從溶液中析出，這種作用就叫做鹽析。這樣析出的蛋白質仍可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質的性質。因此，鹽析是一個可逆的過程。利用這個性質，可以采用多次鹽析的方法來分離、提純蛋白質
蛋白質在水溶液中的溶解度取決于蛋白質分子表面離子周圍的水分子數目，亦即主要是由蛋白質分子外周親水基團與水形成水化膜
的程度以及蛋白質分子帶有電荷的情況決定的。蛋白質溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質溶液后由于離子強度發生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，使蛋白質分子之間聚集而沉淀。由于各種蛋白質在不同鹽濃度中的溶解度不同，不同飽和度的鹽溶液沉淀的蛋白質不同，從而使之從其他蛋白中分離出來。簡單的說就是將硫酸銨、硫化鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質在水溶液中的穩定性因素去除而沉淀。
鹽析法簡單方便，可用于蛋白質抗原的粗提、丙種球蛋白的提取、蛋白質的濃縮等。但鹽析法提純的抗原濃度不高，只能用于抗原的初步純化。目前鹽析法應用于免疫球蛋白和酶提取、分離純化、濃縮等和中藥的提取。
第二篇：蛋白質性質實驗 700字
實驗二十一 蛋白質的性質
實驗日期：＿＿年＿＿月＿＿日 星期：＿＿＿＿
[實驗用品]
1.試管、試管架、試管夾、膠頭滴管、酒精燈、火柴，鑷子。
2. 雞蛋清，飽和（NH4）2SO4溶液，蒸餾水，質量分數1%的醋酸鉛溶液，濃HNO3溶液，雞毛。
[實驗操作]
[實驗習題]
1.蛋白質的鹽析是＿＿＿＿＿的，而變性是＿＿＿＿＿的。
2．19xx年，我國首先合成的具有生物活性的蛋白質是 （ ）
A 牛胰島素 B 人胰島素 C ＲＮＡ聚合酶 D ＤＮＡ基因
3. 下列哪條對蛋白質變性的描述是正確的？（ ）
A 蛋白質變性后溶解度增加
B 蛋白質變性后性質不變
C 蛋白質變性后仍具有生物活性
D 蛋白質變性后喪失原有的生物活性
4. 氨基酸與蛋白質共有的性質是：（ ）
A 膠體性質 B 沉淀反應
C 變性性質 D 兩性性質
5. 簡述那些物理因素和化學因素能使蛋白質變性？
[參考答案]
[實驗操作]
Ⅰ①析出蛋白質沉淀 ②加水稀釋后蛋白質沉淀又溶解 ③加入輕金屬的鹽能使蛋白質沉淀，加水稀釋后沉淀又溶解，說明鹽析是一個可逆的過程。
Ⅱ ①加熱后蛋白質產生沉淀 ②蛋白質產生沉淀 ③沉淀不溶解 ④沉淀不溶解 ⑤加熱或加入醋酸鉛能讓蛋白質產生沉淀，且加水后沉淀不溶解，說明蛋白質的變性是不可逆的。Ⅲ ①產生白色沉淀，加熱沉淀變黃色。②含有苯基的蛋白質加入濃硝酸，加熱都會變黃色，說明蛋白質能發生顏色反應。
Ⅴ①有燒焦羽毛氣味。②蛋白質灼燒有燒焦羽毛的氣味。
[實驗習題]
1．可逆 ，不可逆
2．A 3. D 4. D
5.物理因素包括：加熱，加壓，攪拌，振蕩，紫外線照射，超聲波等。
化學因素包括：強酸，強堿，重金屬鹽，三氯乙酸，乙醇，丙酮等。
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