蛋白質測定方法 ——化學報告

蛋白質的檢測 酚試劑法 靈敏度較高

20~250mg 費時 蛋白質在堿性溶酚類、檸檬 液中其肽鍵與酸、硫酸銨、

Cu2+螯合，形成tris緩沖液、甘蛋白質一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物 氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用

由上表可大致了解五種檢測蛋白質的方法，下面以實驗的形式進行詳細闡述：

1 材料與方法

1.1 儀器材料

(1)儀器:凱氏定氮儀、紫外分光光度計、可見光分光光度計、工作離心機、布氏漏斗、抽濾泵。

(2)試劑及原材料:牛奶、酸奶、豆漿、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸鈉緩沖液、乙醇-乙醚等體積混合液、濃H2SO4 、40%氫氧化鈉、30%過氧化氫、2%硼酸溶液、0. 050molPL標準鹽酸溶液、硫酸鉀- 硫酸銅接觸劑、混合指示劑、標準蛋白溶液、雙縮脲試劑、考馬斯亮藍G- 250試劑。

1.2 實驗方法

(1)凱氏定氮法測定蛋白質含量

將待測樣品與濃硫酸共熱,含氮有機物即分解產生氨(消化) ,氨又與硫酸作用,變成硫酸銨。為了加速消化,可以加入CuSO4 作催化劑和加入K2SO4 以提高溶液的沸點,而加入30%過氧化氫有利于消化溶液的澄清。消化好的樣品在凱氏定氮儀內經強堿堿化使之分解放出氨,借蒸汽將氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用標準鹽酸溶液進行滴定,記錄,計算出樣品含氮量。每個樣品做三次重復測定,取平均值。

(2)紫外吸收法測定蛋白質含量

蛋白質分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵,使蛋白質具有吸收紫外光的性質,吸收峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質含量成正比。此外,蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下,蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系,可以進行蛋白質含量的測定。

紫外吸收法簡便、靈敏、快速,不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如,

…… …… 余下全文

實驗一 雙縮脲法測定血清蛋白質含量

【實驗名稱】：雙縮脲法測定血清蛋白質含量

09救援一班 第三大組 李嵐宇 2009222336

室溫：20°

（一）實驗目的： 1.掌握雙縮脲法測定蛋白質的原理。2.學習掌握分光光度計的使用。

3.掌握標準曲線的制作。4.學習分光光度法測定的原理和方法。

（二）實驗原理：血清中蛋白質的肽鍵（-CO-NH-）在堿性溶液中能與2價銅離子作用生成穩定的紫紅色絡合物。此反應和兩個尿素分子縮合后生成的雙縮脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應相似，故稱之為雙縮脲反應。這種紫紅色絡合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內與血清蛋白含量呈正比關系，經與同樣處理的蛋白質標準液比較，即可求得蛋白質含量。

（三）實驗材料與儀器：

1.儀器和材料： 分光光度計、7支試管、1毫升刻度吸管3支、移液器、坐標紙。

2.試劑：6mol/L的NaOH、雙縮脲試劑、9g/L的NaCl溶液、蛋白質標準液（10g/L)、待測血清樣本。

（四）實驗步驟和結論:

1.取7支試管，編號，按照圖1操作并記錄。

表 1

2.在坐標紙上以各管蛋白質含量為橫坐標，光吸收值（兩管平均值）為縱坐標，繪制標準曲線。

表2

3、由標準曲線查出待測的血清樣本的蛋白質濃度，由表1得出測定管的蛋白質的λ光吸收值為0.317，由表2得出測定管的蛋白質的濃度為1.4g/L

4、按照光吸收法計算公式計算，從標準管中選一管與測定管光吸收值接近者，按公式

C標A測C測?A標

計算待測血清樣本的蛋白質濃度，從上可選A測 = 0.317

C標=0.354 ,A標=1.6 g/L; 則得到：C測=1.432 g/L

【注意事項】 ： 1.本實驗是定量實驗，要求所有玻璃儀器必須清潔，整齊、干燥。蛋白質標準液和血清取量必須準確。

…… …… 余下全文

實驗報告：檢測生物組織中的糖類、脂肪和蛋白質 班級： 學號： 姓名： 一、 實驗原理：

1. 某些化學試劑能使生物組織中得有關化合物產生特定的反應。

2. 糖類中的還原糖，如、 與 發生作用，生成。

3. 脂肪可以被染成橘黃色，或被染成紅色。

4. 蛋白質與反應。

二、 材料用具：

實驗材料： 。

用具：雙面刀片，試管，試管夾，大小燒杯，小量筒，三腳架，石棉網，火柴，載玻片，蓋玻片，毛筆，吸水紙，顯微鏡等。

試劑：斐林試劑，甲液：質量濃度為乙液：質量濃度為 ；蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液，雙縮脲試劑：A液：質量濃度為 ，B液質量濃度為

三、 方法步驟：

（一） 還原糖的檢測和觀察

①向試管內注入2ml 。（選擇具體材料）

②向試管內注入 斐林試劑，（甲液和乙液 再注入。）

③將試管放入盛有 的大燒杯中加熱 。

④觀察試管中出現的顏色變化。

（二） 脂肪的檢測和觀察

制作花生子葉臨時裝片，用顯微鏡觀察花生子葉細胞的著色情況。

①取材：取一�；ㄉ�子葉，去掉 。

②切片：用刀片在花生子葉的 上平行切下若干薄片，放入盛有清水的培養皿中待用。 ③制片：從培養皿中選取 的切片，用毛筆蘸取放在載玻片中央，在花生子葉薄片上滴 2—3滴 ，染色 。用吸水紙吸去染液，再滴加1—2滴 溶液。洗去浮色，用吸水紙吸去花生子葉周圍的酒精，滴一滴 ，蓋上蓋玻片，制成臨時裝片。 ④觀察：在 下找到花生子葉的最薄處，移到 ，將物象調節清楚，換上 觀察，視野中央被染成 的脂肪顆粒清晰可見。

…… …… 余下全文

生物化學實驗報告

姓 名：

學 號：

專業年級：

組 別：

生物化學與分子生物學實驗教學中心

實驗名稱 血清總蛋白測定（雙縮脲試劑法）

實驗地點

指導老師

教師簽名 第五實驗室 實驗日期 2014-11-21 合作者 評分 批改日期

一、實驗目的

1、掌握雙縮脲測定血清總蛋白的基本原理、操作；

2、熟悉血清總蛋白的臨床意義；

3、了解雙縮脲法測定血清總蛋白的特點和注意事項。

二、實驗原理

（一）：雙縮脲反應

在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOC－NH－CONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡合物,這個反應叫做雙縮脲反應。兩分子尿素加熱脫氨縮合成的雙縮脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子內含有兩個鄰接的肽鍵，在堿性溶液中可與Cu2+發生雙縮脲反應 ，生成紫紅色絡合物；蛋白質分子含有大量彼此相連的肽鍵（-CO-NH-），同樣能在堿性條件下與Cu2+發生雙縮脲反應，生成的紫紅色絡合物，且在540nm處的吸光度與蛋白質的含量在10～120g/L范圍內有良好的線性關系。

三、材料與方法：

實驗材料

樣品：大牛血清

試劑：雙縮脲試劑、蛋白質標準液（70g/L）、生理鹽水（0.9%）

器材：試管、加樣槍、刻度吸管、洗耳球

設備：1100分光光度計、水浴鍋

實驗步驟

四、結果與討論： （一）：實驗結果

1、實驗現象：

a、在實驗中首先加入雙縮脲試劑，再依次加入0.9%氯化鈉溶液、蛋白質標準液、相應的大牛血清后溶液沒有明顯的顏色變化，呈淡藍色透明狀；

b、水浴20分鐘之后，B試管試管顯淡藍色；S試管和U試管顯淺紫色且S試管的顏色比U試管的顏色稍深。

2、實驗數據：

管號 測定次數 平均吸光度 1 2 3 S 0.187 0.188 0.187 0.1873 U 0.120 0.119 0.119 0.1193

…… …… 余下全文

實驗一 蛋白質的含量測定-雙縮脲法

一． 實驗目的：掌握雙縮脲法測定蛋白濃度的原理及方法。

二．實驗原理

1. 雙縮脲反應:

在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)與CuSO4作用形成紫紅色的絡合物，在540nm處有最大吸收，這一反應稱為“雙縮脲反應”。凡具有兩個或兩個以上的肽鍵(-CO-NH-)的化合物都呈雙縮脲反應。蛋白質分子中因含有很多的肽鍵，故所有蛋白質都有雙縮脲反應。在一定的濃度范圍內，生成的顏色深淺與蛋白質含量成正比，因此可用作蛋白質定量測定。

由于參與反應的是蛋白質的肽鏈結構，與組成蛋白質分子肽鏈氨基酸殘基的側鏈功能關系較少。因此，不同蛋白質的雙縮脲反應基本相似。

2. 分類:

常量法：測定蛋白質濃度范圍：1∽10mg/ml,選用540nm比色測定。

微量法：選在310∽330nm檢測，靈敏度比540nm檢測高10倍。

優點: ①利用雙縮脲反應生成有色物質用作蛋白質的比色測定受蛋白質種類影響較小, 是優點之一。

②試劑和操作的簡單、迅速也是其優點。

缺點: 靈敏度較差，僅適用于蛋白質濃度在0 .5mg/ml以上的樣品測定 。Tris緩沖液、類脂、色素、

一些氨基酸等會干擾此測定。

3. 本實驗原理:

本實驗選用面粉作為測試樣品，測定面粉中的蛋白質含量。

三．試劑和器材

1．測試樣品：面粉。

2．試劑：

① 標準蛋白質溶液：10mg/mL牛血淸白蛋白（BSA）溶液。

② 常量法的雙縮脲試劑。

③ 0.05mol/L NaOH溶液。

3．器材：分光光度計，電子分析天平，移液管(10 mL×2)，離心機。

。

1

四．實驗操作

1.標準曲線的繪制：

②用Excel 繪制標準曲線及計算公式，如圖：

2.樣品測定

①準確稱取干面粉0.1g,置干燥三角瓶內，另取一個三角瓶作空白。 ②按下表操作:

…… …… 余下全文

雙縮脲法測定小麥面粉中蛋白質的含量

實驗八 雙縮脲法測定面粉中蛋白質的含量

一、目的要求

1．學習雙縮脲法的基本原理及操作。 2．通過實驗學會制作標準曲線。 二、實驗原理：

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。在一定的濃度范圍內，紫色絡合物顏色深淺與蛋白質含量呈線性關系（即：顏色的深淺與蛋白質濃度成正比）而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可在540nm處比色用來測定蛋白質含量。測定范圍為1－10mg蛋白質/ml。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定。 三、操作方法：

1．標準曲線的制作。酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素來配制則需用0.05M NaOH做溶劑，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。）

管號

酪蛋白(ml) 蒸餾水(ml) 雙縮脲試劑(ml) 1 0 2 3

A540 0

計算出各管濃度（計算出各管濃度，再做標準曲線，那么最后計算的公式中就不用除以6了，這么做好理解些。）

混勻，放置30分鐘后，在540nm處以1號管調0點，測定各管吸光度，以吸光度（OD值）為縱坐標，蛋白質濃度（酪蛋白的毫克數）為橫坐標繪制

2 3

0.4 0.8 1.6 1.2 3 3

混勻，放置30分鐘

4

1.2 0.8 3 5 1.6 0.4 3 6 2 0 3

雙縮脲法測定小麥面粉中蛋白質的含量

標準曲線。

四、樣品處理

1．0.25g小麥面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml雙縮脲試劑（四氯化碳為有機溶劑，在這里作為分散劑，使面粉不成團。）；

…… …… 余下全文

實驗一:雙縮脲法測定蛋白質含量

一 目的 掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的原理及方法。

二 原理

雙縮脲( )是兩分子尿素經180℃左右加熱,放出一分子氨( NH3)后得到的產物。在強堿溶液中，雙縮脲與CUSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。其原因是含有兩個及以上肽鍵或類似肽鍵有化合物都具有類似雙縮脲反應。蛋白質含有多個

2+肽鍵，在堿性溶液中能與CU絡合成紫紅色的絡合物。其顏色的深淺與被測樣品中蛋白質濃

度呈正比，而與蛋白質分子量和氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。該法對樣品中蛋白質含量要求相對較高，一般在1—10mg/L蛋白質。tris（三甲羥基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等會于擾該測定。

在一定濃度范圍內，反應后顏色與被測樣品蛋白質含量呈線性關系，即蛋白質濃度越高，體系的顏色越深。反應產物在540nm處有最大吸收峰（吸光度）。

將未知濃度的樣品溶液與一系列已知濃度的標準蛋白質溶液同時與雙縮脲試劑反應，并在540nm處比色，可通過標準濃度蛋白質繪制的標準曲線，求得未知樣品中的蛋白質含量（濃度）。

由于本法操作簡便、迅速、蛋白質濃度與光密度的線性關系好，故對蛋白質快速而不需要十分精確的測定可用此法。

三 儀器與器材

可見光分光光度計、水浴鍋、分析天平、振蕩機（器）、漏斗、試管架、具塞三角瓶（100ml） 容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）試管（1.5cmX15cm）。

四 試劑

1、雙縮脲試劑 稱取硫酸銅（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸鉀鈉（ ）6.0g，分別用250 ml蒸餾水溶解后，一并轉入1000 m l容量瓶中，在攪拌下（可用旋渦混合器或搖動）加入30 ml10%(質量分數)NaOH溶液，然后用蒸餾水稀釋至刻度（1000ml）。將該試劑貯存于塑料瓶或內壁涂以石蠟的瓶內。此試劑可長期保存（須無紅色或黑色沉淀出現），長期使用。

…… …… 余下全文