實驗一 蛋白質及氨基酸的呈色反應

一、實驗目的

1、了解構成蛋白質的基本結構單位及主要聯接方式

2、了解蛋白質和某些氨基酸的呈色反應原理

3、學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法

二、實驗原理

1. 雙縮脲反應(biuret reaction)

蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。

2. 茚三酮反應(ninhydrin reaction)

蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發生茚三酮反應。

3.苯環的黃色反應

Tyr

Trp Phe+少量濃硫酸+濃硝酸

黃色

4. 乙醛酸的反應：

檢測Trp或含Trp蛋白質的反應。當Trp與乙醛酸和濃硫酸在試管中滴加時，產生分層現象，界面出現紫色環。主要是由于蛋白質中的吲哚環作用。

5. 偶氮反應

偶氮化合物都含有-N=N-這樣結構，通常作為染料。

6. 醋酸鉛反應

H2N?Pr?COOH?Pb2???NH2?Pr?COO?2Pb? 三、實驗步驟

1. 雙縮脲反應(biuret reaction)

取1支試管，加乳蛋白溶液（蛋清：水= 1：9）約1ml和10%NaOH約2ml，搖勻，再加1%CuSO4溶液2滴，隨加隨搖。觀察現象，記錄。 2. 茚三酮反應(ninhydrin reaction)

（1）取2支試管分別加入蛋白質溶液（蛋清：水= 1：9）和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮，混勻，沸水浴中加熱1-2分鐘，觀察顏色是否由粉紅色變紫紅色再變藍色。

（2）在一塊小濾紙上滴1滴0.5%的甘氨酸溶液，風干后再在原處滴1滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干顯色，觀察是否有紫紅色斑點的出現。 3.苯環的黃色反應

向6個試管中按下表加試劑，觀察現象并記錄。雞蛋清溶液（蛋清：水= 1：9）

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實驗五 蛋白質的性質實驗——蛋白質及氨基酸的呈色反應

一、實驗目的

1．了解構成蛋白質的基本結構單位及主要連接方式。

2．了解蛋白質和某些氨基酸的呈色反應原理。

3．學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法。

Ⅰ 雙縮脲反應

二、實驗原理

尿素加熱至180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環境中能與Cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發生此反應�？捎糜诘鞍踪|的定性或定量測定。

因此，一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。

三、材料、儀器與試劑

尿素；10%氫氧化鈉溶液；1%硫酸銅溶液；2%卵清蛋白溶液

四、實驗操作

取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1ml，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現的粉紅顏色。要避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。

向另一試管加卵清蛋白溶液約1ml和10%氫氧化鈉溶液約2ml，搖勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫瑰色的出現。

Ⅱ 茚三酮反應

二、實驗原理

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有α—氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。

β—丙氨酸、氨和許多一級胺都呈陽性反應。尿素、馬尿酸、二酮吡唪和肽鍵上的亞氨基不呈現此反應。因此，雖然蛋白質和氨基酸均有茚三酮反應，但能與茚三酮呈陽性反應的不一定就是蛋白質或氨基酸。在定性、定量測定中，應嚴防干擾物存在。

三、材料、儀器與試劑

蛋白質溶液；2%卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液

四、實驗操作

①取2支試管分別加入蛋白質溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1~2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍。

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實驗三 蛋白質及氨基酸的呈色反應

一、實驗目的

1、了解蛋白質和某些氨基酸的特殊顏色反應及其原理

2、掌握幾種常用鑒定蛋白質和氨基酸的方法

二、實驗內容

對蛋白質及氨基酸的雙縮脲反應、茚三酮反應、黃色反應、乙醛酸反應、偶氮反應、醋酸鉛反應等顏色及沉淀反應進行定性確定。

三、實驗操作

（一） 雙縮脲反應

1、實驗原理

當尿素加熱到180℃左右時，兩個分子的尿素縮合可放出一個分子氨后形成雙縮脲，雙 縮脲在堿性溶液中與銅離子結合生成復雜的紅色配合物，此呈色反應稱為雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有多個肽鍵，其結構與雙縮脲相似，故能呈此反應，而形成紫紅色或藍紫色的配合物。此反應常用作蛋白質的定性或定量的測定。

2、試劑

(1)尿素

(2)10%NaOH溶液

(3)1%CuSO4溶液

(4)蛋白質溶液：將雞蛋清用蒸餾水稀釋10~20倍，3層紗布過濾，濾液冷藏備用。

3、操作

（1）取少許結晶尿素放在干燥試管，微火加熱，則尿素開始熔化，并形成雙縮脲，釋放的氨可用濕潤的紅色石蕊試紙鑒定。待熔融的尿素開始硬化，試管內有白色固體出現，停止加熱，讓試管緩慢冷卻。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO4 2~3滴，混勻后觀察顏色的變化。

（2）另取一試管，加蛋白質溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO4 2~3滴，振蕩后將出現的紫紅色與雙縮脲反應所產生的顏色相對比。

（二） 茚三酮反應

1、實驗原理

除脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮作用生成黃色物質外，所有α-氨基酸與茚三酮發生反應 生成紫紅色物質，最終形成藍紫色化合物。1︰1500000濃度的氨基酸水溶液即能發生反應而顯色。反應的適宜pH為5~7。此反應目前廣泛地應用于氨基酸定量測定。

2、試劑

蛋白質溶液 （同前）；0.5% 甘氨酸；0.5%茚三酮水溶液

3、操作

取2支試管分別加入蛋白質溶液和甘氨酸溶液各1 ml，再各加0.5 ml 0.1%茚三酮水溶 液，混勻，在沸水浴加熱2~3分鐘，觀察顏色變化。

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,實驗二 蛋白質及氨基酸的呈色反應

一、實驗目的

1、了解蛋白質和某些氨基酸的特殊顏色反應及其原理

2、掌握幾種常用鑒定蛋白質和氨基酸的方法

二、實驗內容

對蛋白質及氨基酸的雙縮脲反應、茚三酮反應、黃色反應、乙醛酸反應、偶氮反應、醋酸鉛反應等顏色及沉淀反應進行定性確定。

三、實驗操作

（一） 雙縮脲反應

1、實驗原理

當尿素加熱到180℃左右時，兩個分子的尿素縮合可放出一個分子氨后形成雙縮脲，雙 縮脲在堿性溶液中與銅離子結合生成復雜的紅色配合物，此呈色反應稱為雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有多個肽鍵，其結構與雙縮脲相似，故能呈此反應，而形成紫紅色或藍紫色的配合物。此反應常用作蛋白質的定性或定量的測定。

2、試劑

(1)尿素

(2)10%NaOH溶液

(3)1%CuSO4溶液

(4)蛋白質溶液：將雞蛋清用蒸餾水稀釋10~20倍，3層紗布過濾，濾液冷藏備用。

3、操作

（1）取少許結晶尿素放在干燥試管，微火加熱，則尿素開始熔化，并形成雙縮脲，釋放的氨可用濕潤的紅色石蕊試紙鑒定。待熔融的尿素開始硬化，試管內有白色固體出現，停止加熱，讓試管緩慢冷卻。然后加10% NaOH溶液 1 ml和1% CuSO4 2~3滴，混勻后觀察顏色的變化。

（2）另取一試管，加蛋白質溶液 1ml、10% NaOH溶液2ml及1% CuSO4 2~3滴，振蕩后將出現的紫紅色與雙縮脲反應所產生的顏色相對比。

（二） 蛋白黃色反應

1、實驗原理

蛋白質分子中含有苯環結構的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等，這類蛋白質可 被濃硝酸硝化生成黃色的硝基苯的衍生物。該物質在酸性環境中呈黃色，在堿性環境中轉變為橙黃色的硝醌酸鈉。絕大多數蛋白質都含有芳香族氨基酸，因此都有黃色反應。皮膚、毛發、指甲等遇濃HNO3變黃即發生此類黃色反應結果。

2、試劑

(1)蛋白質溶液（同前）；(2)頭發；(3)指甲屑；(4)0.5%苯酚溶液；(5)0.3%酪氨酸溶液；

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實驗二 蛋白質及氨基酸的呈色反應

【實驗目的】

1.了解構成蛋白質的基本結構單位及主要連接方式。

2.了解蛋白質和某些氨基酸的呈色反應原理。

3.學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法。

（一）雙縮脲反應

【實驗原理】

? 尿素加熱至180℃左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環境中能與cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發生此反應�？捎糜诘鞍踪|的定性或定量測定。

? 一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。

【實驗器材及試劑】

器材：

試管、酒精燈、試管夾、試管架

試劑：

（1）尿素

（2）10%氫氧化鈉溶液

（3）1%硫酸銅溶液

（4）2％卵清蛋白溶液

【實驗步驟】

? 取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10％氫氧化鈉溶液約1毫升，振蕩混勻，再加1％硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現的粉紅顏色。避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。

? 向另一試管加卵清蛋白溶液約l毫升和10％氫氧化鈉溶液約2毫升，搖勻，再加1％硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖，觀察紫玫色的出現。

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（二）茚三酮反應

【實驗原理】

? 除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有α—氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。

? 該反應十分靈敏，1：1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應，是一種常用的氨基酸定量測定方法。

? 茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分于和氨縮合生成有色物質。

? 反應機理如下：

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實驗十一 蛋白質與氨基酸的顯色反應

一、實驗目的

1、了解構成蛋白質的基本結構單位及主要連接方式。

2、了解蛋白質和某些氨基酸的顯色反應原理。

3、學習幾種常用的鑒定蛋白質和氨基酸的方法。

（一）雙縮脲反應

1、實驗原理

尿素加熱至180℃左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環境中能與cu2+結合生成紫紅色化合物，此反應稱為雙縮脲反應。蛋白質分子中有肽鍵，其結構與雙縮脲相似，也能發生此反應�？捎糜诘鞍踪|的定性或定量測定。

一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。

2、實驗器材及試劑

（1）器材： 試管、酒精燈、試管夾、試管架

（2）試劑： 1）尿素

2）10%氫氧化鈉溶液

3）1%硫酸銅溶液

4）2%卵清蛋白溶液，或新鮮雞蛋清溶液（將雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，

3層紗布過濾，濾液冷藏備用）。

3、實驗步驟

（1）取少量尿素結晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10%氫氧化鈉溶液約1毫升，振蕩混勻，再加1%硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現的粉紅顏色。避免添加過量硫酸銅，否則，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。

（2）向另一試管加卵清蛋白溶液約1毫升和10%氫氧化鈉溶液約2毫升，搖勻，再加

1%

硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖，觀察紫玫色的出現。

（二）茚三酮反應

1、實驗原理

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有α-氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。該反應十分靈敏，1：1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應，是一種常用的氨基酸定量測定方法。

茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分于和氨縮合生成有色物質。此反應的適宜pH為5-7，同一濃度的蛋白質或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。此反應目前廣泛地應用于氨基酸定量測定。

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實驗9 蛋白質及氨基酸的顏色反應

一、目的和要求

1、了解蛋白質和某些氨基酸的特殊顏色反應及其原理

2、掌握幾種常用鑒定蛋白質和氨基酸的方法

二、試劑

1. 雞蛋清。

2. 蛋白質溶液：將雞蛋清用蒸餾水稀釋10~20倍，3層紗布過濾，濾液冷藏備用。

3. 10% NaOH溶液；20% NaOH。

4. 濃硝酸（比重1.42）；濃鹽酸；濃硫酸（分析純）；冰醋酸（一般含有乙醛酸雜質，

故可用冰醋酸代替乙醛酸）。

5. 1% CuSO4溶液。

6. 10% Pb(Ac)2溶液（醋酸鉛溶液）。

7. 醋酸鉛試紙：將濾紙條浸入10% 醋酸鉛溶液中，濕透后取出，100℃烘干即可。

8. 0.5% 甘氨酸溶液。

9. 0.3% 色氨酸溶液。

10. 0.3% 酪氨酸溶液。

11. 0.3% 精氨酸。

12. 0.3% 組氨酸溶液。

13. 0.1% 茚三酮水溶液。

14. 0.1% 茚三酮-乙醇溶液（稱取0.1g茚三酮，溶于100mL 95% 乙醇。臨用前配制）。

15. 頭發；指甲屑。

16. 0.5% 苯酚溶液。

17. 1% α-萘酚乙醇溶液，臨用時配制。

18. NaBrO溶液：2克溴溶于100ml 5% NaOH中，置棕色瓶中，可在暗處保存兩周。

19. 偶氮試劑：

溶液A：5克亞硝酸鈉溶于1000ml水中。

溶液B：5克對氨基苯磺酸溶于1000ml水中，溶解后再加入5ml濃硫酸。

A、B溶液分別保存在密閉瓶中，用時以等體積混合。

三、實驗內容

對蛋白質及氨基酸的雙縮脲反應、茚三酮反應、黃色反應、坂口反應、乙醛酸反應、偶氮反應、醋酸鉛反應等進行定性確定。

（一）雙縮脲反應

1、實驗原理

當尿素加熱到180℃左右時，兩個分子的尿素縮合可放出一個分子氨后形成雙縮脲，雙 縮脲在堿性溶液中與銅離子結合生成復雜的紅色配合物，此呈色反應稱為雙縮脲反應。由于蛋白質分子中含有多個肽鍵，其結構與雙縮脲相似，故能呈此反應，而形成紫紅色或藍紫色的配合物。此反應常用作蛋白質的定性或定量的測定。

…… …… 余下全文