實驗一:雙縮脲法測定蛋白質含量

一 目的 掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的原理及方法。

二 原理

雙縮脲( )是兩分子尿素經180℃左右加熱,放出一分子氨( NH3)后得到的產物。在強堿溶液中，雙縮脲與CUSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。其原因是含有兩個及以上肽鍵或類似肽鍵有化合物都具有類似雙縮脲反應。蛋白質含有多個

2+肽鍵，在堿性溶液中能與CU絡合成紫紅色的絡合物。其顏色的深淺與被測樣品中蛋白質濃

度呈正比，而與蛋白質分子量和氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。該法對樣品中蛋白質含量要求相對較高，一般在1—10mg/L蛋白質。tris（三甲羥基氨基甲烷）、一些氨基酸、EDTA（乙二胺四乙酸）、草二酰胺、多肽等會于擾該測定。

在一定濃度范圍內，反應后顏色與被測樣品蛋白質含量呈線性關系，即蛋白質濃度越高，體系的顏色越深。反應產物在540nm處有最大吸收峰（吸光度）。

將未知濃度的樣品溶液與一系列已知濃度的標準蛋白質溶液同時與雙縮脲試劑反應，并在540nm處比色，可通過標準濃度蛋白質繪制的標準曲線，求得未知樣品中的蛋白質含量（濃度）。

由于本法操作簡便、迅速、蛋白質濃度與光密度的線性關系好，故對蛋白質快速而不需要十分精確的測定可用此法。

三 儀器與器材

可見光分光光度計、水浴鍋、分析天平、振蕩機（器）、漏斗、試管架、具塞三角瓶（100ml） 容量瓶（250 ml、500 ml、1000 ml）、刻度吸管（1.0 ml 2.0 ml 5.0 ml）試管（1.5cmX15cm）。

四 試劑

1、雙縮脲試劑 稱取硫酸銅（CUSO4·5H2O）1.5g，酒石酸鉀鈉（ ）6.0g，分別用250 ml蒸餾水溶解后，一并轉入1000 m l容量瓶中，在攪拌下（可用旋渦混合器或搖動）加入30 ml10%(質量分數)NaOH溶液，然后用蒸餾水稀釋至刻度（1000ml）。將該試劑貯存于塑料瓶或內壁涂以石蠟的瓶內。此試劑可長期保存（須無紅色或黑色沉淀出現），長期使用。

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實驗17 蛋白質含量測定（雙縮脲法）

一、目的

掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的原理和方法。掌握分光光度計的使用方法。 二、原理

堿性溶液中雙縮脲（ NH 2 一 co 一 NH 一 co 一 NH 2 ）能與 Cu 2 + 產生紫紅色的絡合物，這一反應稱為“雙縮脲反應”。蛋白質分子中的肽鍵也能與銅離子發生雙縮脲反應，溶液紫紅色的深淺與蛋白質含量在一定范圍內符合朗伯一比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子質量無關。其可測定范圍為 1- l0mg 蛋白質，適用于精度要求不高的蛋白質含量測定。 Tris ，一些氨基酸， EDTA 等會干擾該測定。 三、儀器、試劑和材料 1 ．儀器

（ 1) 分光光度計 （ 2 ）分析天平 （ 3 ）振蕩機 （ 4 ）刻度吸管： 1m1X2 ， 5m1X2 ， 10m1 X 1 (5 ）具塞三角瓶： 1OOml （ 6 ）漏斗： 13 個 2 ．試劑

（ 1 ）雙縮脲試劑：取硫酸銅（ Cu S0 4 5H 2 O ） 1.5g 和酒石酸鉀鈉（ NaKC 4 H 4 O 6 .4H 2 O ） 6.0g ，溶于 500m1 蒸餾水中，在攪拌的同時加入 300m1 10% NaOH 溶液，定容至 1000 ml ，貯于涂石蠟的試劑瓶中。 （ 2 ） 0.05mol/L 的 NaOH 。 (3) 標準酪蛋自溶液：準確稱取酪蛋白 0.5g 溶于 0.05mol/ L 的 NaOH 溶液中，并定容至 100m1, 即為 5mg/m1 的標準溶液。 3 ．材料

小麥、玉米或其他谷物樣品，風干、磨碎并通過 100 目銅篩。 四、操作步驟

1 ．標準曲線的繪制

取 6 支試管，編號，按下表加入試劑：

震蕩 15min ，室溫靜置 30min ， 54Onm 比色，以蛋白質含量（ mg ）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。 2 ．樣品測定

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實驗三 雙縮脲法測定蛋白質含量

目的

1．掌握雙縮脲法測定蛋白質的具體操作和原理；

2．了解蛋白質測定在生命科學中的應用。

原理

雙縮脲反應是指雙縮脲在鹼性溶液中能與Cu絡合生成紫紅色物質。雙縮脲可由脲縮合而成。

2+

蛋白質分子的肽鏈結構在鹼性中也能與Cu絡合生成紫紅色絡合物，因其反應機制相似，就把蛋白質的這一反應稱為蛋白質的雙縮脲反應。

2+

由于參與反應的是蛋白質的肽鏈結構，與組成蛋白質分于肽鏈氨基酸殘基的側鏈功能基關系較小。因此，不同蛋白質的雙縮脲反應基本相似。利用雙縮脲反應生成的有色物質作蛋白質的比色測定受蛋白質種類的影響較小。這是本法的優點之一。此外試劑和操作的簡單也是其優點。缺點是靈敏度較低，能測出的蛋白質濃度約須在0.5mg／ml。

本實驗用雙縮脲法測定血清的總蛋白質濃度。如結合鹽析法(飽和硫酸鈉)分離白蛋白和

球蛋白還可用于血清白蛋白和球蛋白濃度及其比值(A／G)的測定。

器材

1．試管及試智架

2．0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)

3．1ml、2ml、5ml刻度吸管

4．721型分光光度計

試劑

1．0.9％NaCl

2．雙縮脲試劑 稱取CuSO45H2O結晶(AR級試劑)1.5g,酒石酸鉀鈉(AR級試劑)6.0g溶于500ml水中，添加10％NaOH 300ml及KI1.0g．混勻后加水稀釋至1000ml。本試劑可長期保存。

3．牛血清白蛋白標準液 此溶液可用于替代標準血清。稱取試劑級凍干牛血清白蛋白300mg置lOOml容量瓶中，用0.9％NaCl溶解后稀釋至刻度，避免振搖起泡，置4℃冰箱保存。此標準液濃度為300mg／m1。

4．被檢血清樣本

操怍

1. 取試管1支，以0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)吸取被檢血清0.200ml(吸管外壁須用濾紙片拭凈)。慢慢放入試管底部。最后一點液體應吹出，靠落在試管壁上。

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實驗二十 蛋白質含量測定——雙縮脲法測定蛋白質含量

一、實驗目的

學習和掌握用雙縮脲法測定蛋白質含量的原理和方法。

二、實驗原理

在堿性溶液中，雙縮脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)與二價銅離子作用形成紫紅色的絡合物，這一反應稱雙縮脲反應。凡分子中含二個或二個以上酰胺基(—CO-NH2)，或與此相似的基團[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，無論這類基團直接相連還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發生上述反應。蛋白質分子含有眾多肽鍵(—CO-NH—)，可發生雙縮脲反應，且呈色強度在一定濃度范圍內與肽鍵數量即與蛋白質含量成正比，可用比色法測定蛋白含量。測定范圍為1～10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定。

三、實驗試劑和器材

[試劑]

1．雙縮脲試劑： 取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸鉀鈉(c.P.)6.0g以少量蒸餾水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。長期放置后若有暗紅色沉淀出現，即不能使用。

2．標準蛋白質溶液： 用標準的結晶牛血清清蛋白（BSA）或標準酪蛋白，配制成10g/L的標準蛋白溶液，可用BSA濃度1g/L的A280為0.66來校正其純度。如有需要，標準蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配制成標準蛋白質溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。

[器材]

1．試管：15×150mm 試管7只；

2．1ml，5ml移液管； 3．坐標紙 ； 4．721分光光度計。

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紫外分光光度法測定蛋白質含量

一、實驗目的

1. 學習紫外光度法測定蛋白質含量的原理；

2. 掌握紫外分光光度法測蛋白質含量的實驗技術。 二、實驗原理

1.測蛋白質含量的方法主要有：①測參數法：折射率、相對密度、紫外吸收等；②基于化學反應:定氮法、雙縮脲法、Folin―酚試劑法等。本實驗采用紫外分光光度法。

2.蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環中含有共軛雙鍵，因此，蛋白質具有吸收紫外光的性質，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白質略有不同）。在最大吸收波長處，吸光度與蛋白質溶液的濃度服從朗伯―比爾定律。

利用紫外吸收法測蛋白質含量的準確度較差，原因有二：①對于測定那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定誤差，故該法適于測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質；②樣品中含有的嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會出現較大干擾。 三、儀器與試劑

TU―1901紫外可見分光光度計、標準蛋白質溶液3.00mg·mL-1、0.9%NaCl溶液、試樣蛋白質溶液。

10mL比色管、1cm石英比色皿、吸量管。 四、實驗步驟

1.繪制吸收曲線

用吸量管吸取2mL3.00mg·mL-1標準蛋白質溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作參比溶液，在190~400nm間每隔5nm測一次吸光度Abs，記錄數據并作圖。

2.繪制標準曲線

用吸量管分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg·mL-1標準蛋白質溶液于10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作參比溶液，在波長280nm處分別測其吸光度，記錄數據并作圖。

3.樣品測定

取適量濃度試樣蛋白質溶液，在波長280nm處測其吸光度，重復三次。在已經得到標準曲線的情況下，為了使測量結果準確度高，待測溶液的濃度需在標準曲線的線性范圍內，所以，先測定試樣蛋白質原液的吸光度（1.363），估算濃度為2.0960 mg·mL-1，再將原試液稀釋至5倍（即取2mL試液，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻），估算濃度為0.4192 mg·mL-1，測吸光度，重復三次 五、數據處理與結果分析

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實驗十二 雙縮脲法測蛋白質含量

【目的和要求】

掌握雙縮脲法定量測寫蛋白質含量的原理和方法。

【原理】

蛋白質含有兩個以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應。在堿性溶液中蛋白質與C u2＋形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與蛋白質的分子在一定的實驗條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質溶液同時反應，并于量及氨基酸成分無關，因此被廣泛地應用。 540～560nm下比色，可以通過標準蛋白質的標準曲線求出未知樣品的蛋白質濃度。標準蛋白質溶液可以用結晶的牛（或人）血清清蛋白、卵清蛋白或粉末配制。 除—CONH—有此反應外，—CONH2，—CH2—NH2，—CS—NH2等基團亦有此反應。

血清總蛋白含量關系到血液與組織間水分的分布情況，在機體脫水的情況下，血清總蛋白質含量升高，而在機體發生水腫時，血清蛋白含量下降，所以測定血清蛋白質含量具有臨床意義。

【操作方法】

一、繪制標準曲線(學生自己列表，依次加入溶液)

取一系列試管，分別加入0， 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0ml的標準酪蛋白溶液（作為標準用的應當用凱氏定氮法測定蛋白氮含量,以確定酪蛋白的純度），用水補足到2ml，然后加入4ml雙縮脲試劑在室溫下（15℃～25℃）放置30min，于540nm波長下用72型分光光度計比色測定。最后以光密度為縱坐標，酪蛋白的含量為橫坐標繪制標準曲線，作為定量的依據。

二、未知樣品蛋白質濃度的測定

未知樣品必須進行稀釋調整，使2ml中含有1～10mg蛋白質，才能進行測定。 吸取1ml 1:10稀釋的血清待測液，用水補足到2ml。操作同前，平行做兩份。

與標準曲線的各管同時比色。比色后從標準曲線上查出其蛋白質濃度，再按照稀釋倍數求出每毫升血清原液的蛋白質含量。

【試劑和器材】

一、試劑

（1）標準酪蛋白溶液（5mg/ml）：用0.05N氫氧化鈉配制。

（2）雙縮脲試劑：溶解1.50克硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉

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首頁 » 資訊 » 實驗常識 » 正文 雙縮脲法測定蛋白質含量 發布日期：2008-07-03 來源：丁香通 瀏覽次數：310

雙縮脲法測定蛋白質含量: 一、 教學目的與要求： ① 加強對蛋白質的有關性質的認識； ②掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的原理和

雙縮脲法測定蛋白質含量:

一、 教學目的與要求：

① 加強對蛋白質的有關性質的認識；

②掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的原理和方法；

③對學生所學進行綜合的測試。

二、 教學實驗原理：

蛋白質含有兩個以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應。在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與蛋白質的分子量氨基酸成分無關，因此利用此進行比色測定蛋白質含量。

在一定條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質溶液同時反應，并于540—560nm下比色，可以通過標準蛋白質的標準曲線求出未知的蛋白質濃度，標準蛋白溶液可以用結晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。

除-CONH-有此反應外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基團亦有此反應。

三、 考核主要內容

1、 標準曲線的制作

取6支干凈的試管，按0→5編號，然后按下表依次加入試劑，充分混勻，在室溫下放置半小時，以管為空白，在550nm波長處測定消光值（OD），以各管蛋白質含量（毫克）橫坐標，OD值為坐標，畫出標線。

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